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    生产的杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒(Baculovirus Shuttle Vector Bacmid Mini Preparation Kit, 简称Bacmid Miniprep Kit)是一种从大肠杆菌DH10Bac中简单快速抽提高质量可完美应用于昆虫细胞转染的bacmid的试剂盒。
主要特点:简单快速,不使用剧毒试剂,无须酚氯仿抽提,无须过柱纯化,有效解决bacmid分子量大、抽提难度高等系列问题,确保抽提获得的bacmid可完美用于昆虫细胞转染。
当目的基因被插入到pFastBac系列载体中构建成目的重组质粒后,该重组质粒可用于转化大肠杆菌DH10Bac从而发生位点特异的转座(site-specific transposition),蓝白斑筛选和PCR鉴定筛选含有重组bacmid的重组子,再使用本试剂盒进行bacmid的小量抽提即可获得可转染昆虫细胞的bacmid DNA。
本试剂盒在抽提bacmid的同时,也会抽提辅助质粒(helper plasmid)和未重组的pFastBac质粒。抽提获得的bacmid等质粒混合物可以直接用于转染昆虫细胞以包装杆状病毒,***终用于目的蛋白在昆虫细胞中的大量表达。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是由Luckow等人于1993年发展的一种快速而有效产生重组杆状病毒的方法。该系统主要包括以下两个组分:(1)用于插入目的基因的pFastBac载体,目的基因插入后受杆状病毒特异性启动子(baculovirus-specific promoter)调控表达;(2)含杆状病毒穿梭载体bacmid (bMON14272, 136kb)和辅助质粒(helper plasmid,用于表达转座必须的转座蛋白)的大肠杆菌DH10Bac宿主菌株。将pfastBac重组质粒转化该菌株可发生pfastBac重组质粒中mini-Tn7元件和bacmid上的mini-attTN7发生转座,从而形成重组的bacmid。
利用Bac-to-Bac杆状病毒感染昆虫细胞产生重组蛋白主要包括以下实验步骤:(1)把目的基因克隆到pFastBac载体产生重组质粒;(2)转化pFastBac重组质粒到DH10Bac大肠杆菌感受态细胞产生重组bacmid;(3)利用杆状病毒穿梭载体bacmid小量抽提试剂盒提取重组bacmid DNA;(4)将重组bacmid DNA转染进入昆虫细胞(推荐使用碧云天的C0551 LipoInsect™转染试剂)以产生重组杆状病毒;(5)扩增重组的杆状病毒并用其感染昆虫细胞以大规模表达重组目的蛋白。
本试剂盒抽提获得的高质量bacmid DNA可以直接用于转染昆虫细胞,碧云天生产的LipoInsect™转染试剂(C0551)适用于将pFastBac等杆状病毒表达载体制备的bacmid转染到Sf9、Sf21和High Five™等昆虫细胞以用于Bac-to-Bac®、BaculoDirect™和InsectSelect™表达系统的蛋白表达。LipoInsect™转染试剂的转染效率非常高,对昆虫细胞Sf9的实测阳性率可达98%以上。
关于昆虫细胞系统的蛋白表达与纯化的详细介绍,请见如下网页: http://www.beyotime.com/support/insect cell.htm。
一个包装的本产品可以进行50次bacmid的小量抽提。

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